Выявлены универсальные для кокцинеллид RAPD-праймеры (ОРА02 и ОРА07).  С использованием отобранных праймеров проведен ПЦР-анализ и оценка ДНК-полиморфизма десяти различных видов божьих коровок.

Ключевые слова:божьи коровки, полиморфизм, ДНК, RAPD-праймеры, ПЦР.

It was revealed universal for Coccinellidae RAPD primers (ОРА02 иОРА07). Using these primers PCR analysis and studying DNA polymorphism of ten different ladybird beetles species was conducted.

Keywords: ladybird beetles, DNA polymorphism, RAPD primers, PCR

Сравнительный генетический анализ различных видов кокцинеллид проводился ранее с использованием молекулярно-генетических методов: анализа полиморфизма длин внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК [Паленко и др., 2004], нуклеотидной последовательности  гена митохондриальной цитохром С оксидазы I (СOI) [Fu, Zhang, 2006] и нуклеотидной последовательности митохондриального гена  16S рДНК [Aruggoda et al., 2010]. Основной целью этих исследований был филогенетический анализ и оценка генетического сходства различных видов божьих коровок.

В то же время сравнительный анализ ДНК-полиморфизма и генетического разнообразия  кокцинеллид по RAPD-маркерам не проводился. Данный метод молекулярно-генетического анализа не требует знания первичной структуры ДНК и, в этой связи, более доступен и прост. Основная трудность заключается в поиске универсальных RAPD-маркеров, одинаково хорошо инициирующих амплификацию с ДНК всех исследуемых видов семейства кокцинеллид и пригодных для оценки ДНК-полиморфизма насекомых.

Подобный подход мы с успехом применяли ранее при сравнительном анализе ДНК-полиморфизма различных отрядов насекомых [Киль и др., 2008;]. Таким образом, нами были выявлены RAPD- и ISSR-праймеры универсальные для полужесткокрылых и некоторых других представителей членистоногих.

Целью наших исследований явилось выявление универсальных для семейства Coccinellidae RAPD-праймеров и оценка ДНК-полиморфизма различных видов насекомых-кокцинеллид по RAPD-маркерам.

Материалы и методы. Объектом исследования являлись выборки насекомых (n=10-32) из природных популяций десяти различных видов кокцинеллид, собранных в полях и садах г. Краснодара (2013-2014 гг.): Coccinellaseptempunctata; Adaliabipunctata; Oenopiaconglobata; Propyleaquatuordecimpunctata; Scymnusfrontalis; Tythaspissedecimpunctata; Coccinulaquatuordecimpustulata; Harmoniaaxyridis; Adoniavariegata; Theavigintiduopunctata. Выделение ДНК проводили из целых особей насекомых (имаго), амплификацию и электрофорез,  как описано нами ранее [Киль, 2009]. В работе использовали следующие RAPD-праймеры: ОРА02, ОРА06, ОРА07, ОРА15, ОРА18, ОРА20, ОРВ01, ОРВ08, OPD12, OPE01, OPE07, OPN15, OPN19, UBC450, UBC490, UBC519, UBC521, UBC531, UBC538, UBC556, 267/2 и GT09. Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров.

Результаты и обсуждение.  В результате исследований нами было проведено тестирование имеющегося в лаборатории набора праймеров на универсальность по отношению к ДНК разных видов кокцинеллид. Из 22-х RAPD-праймеров были отобраны два универсальных кокцинеллид-специфичных праймера (ОРА02 и ОРА07), выявляющих ДНК-полиморфизм и обладающих высокой информативностью. Важно отметить, что праймер ОРА07 оказался также универсальным и для других представителей класса насекомых [Киль и др., 2010].

С использованием отобранных праймеров нами в дальнейшем был проведен сравнительный RAPD-анализ различных видов кокцинеллид (таблица).

В целом по всем  изученным видам насекомых с помощью праймера ОРА02 было выявлено от 9 до 25 RAPD-маркеров; с помощью праймера OPA07 – от 13 до 25. Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРА02 и OPA07 колебалось в зависимости от вида в пределах 2.1 ¸ 7.9 и 5.6 ¸ 9.6, соответственно. Средний уровень полиморфизма составил 92,4 % (ОРА02) и 86,2 % (OPA07). Размеры продуктов амплификации варьировали от 150 до 1500 (ОРА02) и  от 200 до 1400 пар нуклеотидов (OPA07).

Поддержано грантом № 13-04-96509 Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края.

Таблица - Полиморфизм ДНК божьих коровок по универсальным RAPD-маркерам

Литература:

1. Паленко, М.В. Молекулярно-генетические подходы к филогении жуков семейства Божьи коровки (Coleoptera: Coccinellidae) / Паленко М.В. Шайкевич Е.В., Муха Д.В., Захаров И.А. // Энтомологическое обозрение. - 2004 а. - Т.83. - № 4. - C. 876-879.
2. Aruggoda, A.G.B., Shunxiang, R. and Baoli, Q. (2010). Molecular Phylogeny of Ladybird Beetles (Coccinellidae: Coleoptera) Inferred from Mitochondrial 16S rDNA Sequences. Tropical Agricultural Research Vol. 21(2): 209–217.
3. Fu, J. and Zhand, Y.C. (2006). Sequence analysis of mtDNA - COI gene and Molecular Phylogeny on twenty seven Species of Coccinellids (Coleoptera: Coccinellidae). Entomotaxonimia. 28 (3): 179-185.
4. Киль, В.И. Методика оценки ДНК полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR) / В.И. Киль // Методические рекомендации. ООО «Просвещение-Юг». Краснодар. 2009. 16 с.
5. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК и генетическое разнообразие популяций различных видов насекомых / Киль В.И., Беседина Е.Н., Исмаилов В.Я. // Наука Кубани. - 2010. - № 2. - С. 21-24.