Исследован апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов крови у молодых и старых самцов лабораторных животных (мыши, крысы) при иммобилизационном и гипогидратационном стрессе и введении антиоксидантов. Установлено увеличение числа лимфоцитов и нейтрофилов с явными признаками апоптоза под влиянием стресса и уменьшение апоптозных элементов при введении антиоксидантов. Сочетание факторов стресс + антиоксидант привели к снижению апоптоза по сравнению с воздействием чистого стресса, что свидетельствует о стресс-протекторном эффекте антиоксидантов и о их антиапоптическом действии.

Ключевые слова: апоптоз, нейтрофилы, лимфоциты, витамин Е, эмоксипин, иммобилизационный стресс, гипогидратационный стресс.

Проблема старения, гибели и дифференцировки клеток является одной из центральных проблем современной биологии. В процессе эволюции образовалась сложная система контроля за постоянством числа клеток, процесс клеточного суицида известен как апоптоз. Апоптоз является естественным процессом замены тканевых структур и уничтожения состарившихся и дефективных клеток [5, с.493–523; 13, с.44].

Апоптозу принадлежит роль и в развитии процесса старения [8, с. 1694–1717]. К старости организм утрачивает способность верно реагировать на сигналы апоптоза, что приводит к развитию различных патологий, однако, увеличение гибели клеток, необходимо для нормальной жизнедеятельности организма [11, с.633–647; 2, с.7]. Исследования последних лет показали, что патогенез многих болезней, в том числе рака, лейкозов и вирусных инфекций, связан с неспособностью клеток запускать механизм апоптоза [12, с.787–789]. Такие болезни, как СПИД, остеопороз, апластическая анемия, напротив, связаны с повышенной способностью клеток к апоптозу [7, с.330–34. В настоящее время доказана прямая связь между нарушением регуляции апоптоза и заболеваниями иммунной системы.

В последние десятилетия накоплен большой опыт в изучении механизмов апоптоза различных клеток, однако вопрос о гибели клеток белой крови на поздних этапах онтогенеза изучен не полностью. Известно, что процессы апоптоза и старения взаимосвязаны, и влияние на один из них влечет изменение другого. Однако недостаточная изученность и отсутствие точного представления о механизмах регуляции апоптоза клеток белой крови при старении не дает возможность полноценно использовать антиоксиданты как геро- и стрессопротекторы в клинической гериатрии. В связи с этим представляется актуальным исследовать механизмы регуляции апоптоза клеток белой крови при старении, и эффекты антиоксидантов в контроле и при стрессе у разновозрастных животных.

Цель данного исследования- изучить протекторное действие антиоксидантов различной природы (природного — α-токоферола и синтетического — эмоксипина) на физиологический и стресс-индуцированный апоптоз клеток белой крови у лабораторных животных, на разных этапах онтогенеза.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности физиологического апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у молодых и старых мышей и крыс.
2. Изучить влияние иммобилизационного и гипогидратационного стресса на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, и их особенности при старении.
3. Изучить влияние природного антиоксиданта — α-токоферола и синтетического антиоксиданта — эмоксипина на динамику апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у мышей и крыс разных возрастных групп.
4. Изучить влияние стресс-протекторного эффекта α-токоферола и эмоксипина в условиях стресса на уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у лабораторных животных (мыши, крысы) на этапах онтогенеза.

Материалы иметоды

В эксперименте были использованы два вида животных — беспородные белые мыши и беспородные белые крысы двух возрастных групп (молодые и старые). Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении. Все эксперименты выполнены в весеннее–летний период.

Экспериментальный материал получен от двух серий опытов.

I серия опытов выполнена на самцах мышей (90 шт.) двух возрастных групп: молодые-2,5 месяца, средней массой 22,6 г. и стареющие-14 месяцев, средней массой 28,6 г. Различия по массе тела были достоверны.

При проведении опытов использовалась экспериментальная модель — гипогидратационный стресс (водная депривация) в условиях нормальной освещенности. Мыши находились без доступа к воде в течение 4 — х дней.

Животные получали α-токоферол и комплекс α-токоферол и витамин С в качестве антиоксидантов для проверки их анти-стрессорных свойств и антиоксидантных качеств.

Все животные в соответствии с целями и задачами исследования были подразделены на 5 групп (соответственно для каждой возрастной группы):

1. Интактные (контроль);
2. Мыши, подвергшиеся гипогидратационному стрессу в течение четырех дней;
3. Мыши, получавшие масляный 10 % раствор D,L- α-токоферолацетата per os ежедневно в течение 14 дней, в дозе 1 мг./100г. массы тела, и подвергнутые в течение последних 4 дней приема α-токоферола воздействию гипогидратационного стресса.
4. мыши, получавшие масляный 10 % раствор D,L- α-токоферолацетата per os ежедневно в течение 14 дней, в дозе 1 мг./100г. массы тела;
5. Мыши, получавшие масляный 10 % раствор D,L- α-токоферолацетата в дозе 1 мг./100г. массы тела и витамин С в дозе1мг/100 г. массы тела per os в течении 14 дней и подвергнутые в течение последних 4 дней приема витаминов гипогидратационному стрессу.

II серия опытов поставлена на самцах крыс (94 шт.) двух возрастов, молодые (5,5 мес.) средней массой 105,5 г. и старые (27 мес.) средней массой 217,2 г. Различия по массе тела были достоверны.

Экспериментальная модель — иммобилизационный стресс. Животных помещали в тесную пластиковую камеру, ограничивающую их движения, на 2 часа при комнатной температуре. По окончанию опытов крыс декапитировали после предварительной наркотизации внутрибрюшинным введением этаминала натрия (4 мг/ 100 г массы тела животного).

Животные получали α-токоферол и эмоксипин в качестве антиоксидантов для проверки их анти-стрессорных свойств и антиоксидантных качеств.

Животные были подразделены на следующие экспериментальные группы:

1. Интактные животные (контроль);
2. Крысы, подвергшиеся иммобилизационному стрессу в пластиковых цилиндрах соответствующего размера в течение 7 дней по 2 ч. в день;
3. Животные, получавшие 10 % масляный раствор D,L- α-токоферолацетата per os в дозе 1мг/100 г. массы тела ежедневно в течение 14 дней;
4. Крысы, получавшие масляный 10 % раствор D,L- α-токоферолацетата per os ежедневно в течение 14 дней, в дозе 1 мг./100г. массы тела, и подвергнутые в течение последних 7 дней введения витамина действию иммобилизационного стресса;
5. Животные, которым внутримышечно вводили 1 % р-р эмоксипина в дозе 1мг/ 100г. массы тела в течение 7 дней;
6. Крысы, которым внутримышечно вводили 1 % р-р эмоксипина в дозе 1мг/ 100г. массы тела в течение 7 дней, и подвергнутые в этот период воздействию иммобилизационного стресса.

Доза α-токоферола выбрана на основании данных об оптимальном действии витамина Е как антиоксиданта при разовом введении не более 2 мг/100 г. массы тела [3, с.163.

Доза эмоксипина подобрана экспериментально по сходному антиоксидантному действию α-токоферола в дозе 1мг/100г массы тела, т.к литературные данные не содержат сведений о терапевтических дозах для лабораторных животных.

Все экспериментальные данные обрабатывались статистически при помощи определения средней арифметической, её ошибки и достоверности различия между средними сравниваемых групп с помощью критерия t/p Стьюдента [1, с.160]. Достоверным являлись отличия при уровне значимости р<0,05.

Определение уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов проводили с помощью световой и флуоресцентной микроскопии.

Обсуждение результатов исследования

В наших экспериментах количество апоптозных нейтрофилов и лимфоцитов в контроле неодинаково: у старых животных их число значительно выше, чем у молодых мышей и крыс.

Воздействие стресса (гипогидратационный и иммобилизационный) резко повысило уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов в обеих возрастных группах животных (мыши, крысы) в сравнении с контрольными грызунами.

Одним из факторов увеличения уровня апоптоза при старении может быть высокий уровень свободнорадикального окисления [5, с.493–523; 13, с.44]. В настоящее время все больший интерес вызывают антиоксиданты как вещества, способствующие замедлению темпов старения, предупреждению индукции апоптоза при интенсификации свободнорадикальных процессов. Особый интерес представляют те противоокислительные вещества, которые функционируют в живом организме, т. е. биоантиоксиданты, поскольку они играют чрезвычайно важную роль в защите многих биологических структур от свободнорадикального окисления [9, с.90–97]. Прямых доказательств о влиянии α-токоферола на апоптоз клеток крови в литературе мы не обнаружили, однако имеются данные об ингибировании апоптоза α-токоферолом, вызванного различными воздействиями в кератиноцитах, опухолевых клетках печени [10, с.121–130, а также данные о снижении уровня апоптоза витамином Е в ооцитах мышей после воздействия никотина [4, с.880–884].

У молодых и старых животных при введении α-токоферола обнаружена некоторая разница в динамике апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов. У молодых мышей наблюдалась лишь тенденция к снижению уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов по сравнению с интактными, в то время как у старых животных произошло достоверное его снижение. При введении синтетического антиоксиданта эмоксипина отмечена тенденция к снижению уровня апоптоза изучаемых клеток у разновозрастных крыс.

Предварительное двухнедельное введение α-токоферола и комплекса α-токоферол и витамин С животным перед стрессированием способствовало снижению уровня апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов по сравнению с воздействием стресса без предварительного введения витаминов в обеих возрастных группах мышей. При аналогичном экспериментальном воздействии синтетическим антиоксидантом эмоксипином наблюдалась лишь тенденция к снижению уровня апоптоза у разновозрастных животных. Отмечено достоверное различие в динамике апоптоза лимфоцитов у молодых и старых лабораторных грызунов (мыши, крысы) при введении в рацион животных перед стрессированием антиоксидантов различной природы и комплекса витаминов (увеличение уровня апоптоза у старых животных).

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов интенсифицируется с возрастом. α-токоферол оказывает более выраженное антиапоптическое действие на позднем этапе онтогенеза. В условиях стресса α-токоферол снижает стрессорное воздействие на организм, уменьшает уровень апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов, вне зависимости от возраста, но более выражено у старых животных. Эмоксипин в аналогичных условиях менее эффективен как антиоксидант.

Таблица 1

Влияние стресса ивитаминов-антиоксидантов на уровень апоптоза нейтрофилов илимфоцитов мышей (световая микроскопия).

Примечание: (здесь и в остальных таблицах)*-р<0,05, **-р<0,01;***-р<0,001 достоверность различий в сравнении с контрольной группой

#- р<0,05, ##-р<0,01;###-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с стрессированными животными

+- р<0,05, ++-р<0,01;+++-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с старыми животными

±m — ошибка средней

Таблица 2

Влияние стресса иантиоксидантов на уровень апоптоза нейтрофилов илимфоцитов крыс (световая микроскопия).

При исследовании динамики апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов с помощью флуоресцентной микроскопии прослеживается аналогичная закономерность в изменении уровня апоптоза элементов белой крови, что и при световой микроскопии. Однако процент апоптозных нейтрофилов и лимфоцитов оказался несколько выше, чем при световой микроскопии, что связано с тем, что при флуоресцентном окрашивании апоптоз можно наблюдать на ранних стадиях.

Таблица 3

Влияние гипогидратационного стресса ивитаминов на уровень апоптоз нейтрофилов илимфоцитов молодых истарых мышей (люминесцентная микроскопия)

Таблица 4

Влияние стресса иантиоксидантов на уровень апоптоза нейтрофилов илимфоцитов крыс (люминесцентная микроскопия).

Литература:

1. Козак М. Ф. Биометрия: учебное пособие. Астрахань: Изд-во Астрах. пед. ин-та им. С. М. Кирова, 1995. — 160 с.
2. Суханова Г. А., Акбашева О. Е. Апоптоз: учебное пособие.- Томск: Изд. ТПУ.- 2006.- 172 с.
3. Теплый Д. Л. Нейрофизиологические эффекты витамина Е. Астрахань: ЛЕОН.- 2008.- 309с.

4. Asadi E., Jahanshahi M.,. Golalipour M. J. Effect of Vitamin E on Oocytes Apoptosis in Nicotine-Treated Mice //Iran J Basic Med Sci.- 2012.- Vol.15, № 3.-Р. 880–884.

5. Conradt B. Genetic control of programmed cell death during animal development // Annu Rev Genet.- 2009.- Vol.43.-Р. 493–523.

6. Effects of oxidative stress on apoptosis in manganese-induced testicular toxicity in cocks/ Liu X. F. [et al] //Food Chem Toxicol.- 2013.- Vol.60.-Р.168–176.

7. Favaloro B., Allocati N., Graziano V. Role of Apoptosis in disease // Aging (Albany NY).- 2012.- № 4(5).-Р.330–349.

8. Fulle S., Centurione L., Mancinelli R. Stem cell ageing and apoptosis // Curr Pharm Des.- 2012.-№ 18.- Р.1694–1717.

9. Joshi Y.B, Praticò D. Vitamin E in aging, dementia, and Alzheimer's disease //Biofactors.- 2012.- Vol.38, № 2.-Р.90–97.

10. Maalouf S., El-Sabban M., Darwiche N., Gali- Muhtasib H. Protective effect of vitamin E on ultraviolet В light-induced damage in keratinocytes //Mol. Carcinog.- 2002,-Vol. 34, N3.- P.121–130.
11. Pettmann B., Henderson С. E. Neuronal cell death // Neuron. 1998. — Apr 20 (4). — P. 633–647.

12. Ryoo H.D, Bergmann A. The role of apoptosis-induced proliferation for regeneration and cancer// Cold Spring Harb Perspect Biol. -2012.- № 4(8).- 787–789.

13. Schleich K., Lavrik I. N. Mathematical modeling of apoptosis //Cell Commun Signal.- 2013.- Vol. 11,№ 1.- Р.44.