По отношению к цитидину и атипичному нуклеозиду гемцитабину, использование раствора гемцитабина для изучения активности фермента целесообразно.

Ключевые слова: цитидиндезаминаза, цитидин, гемцитабин.

Актуальность. Цитидиндезаминаза является индуктором соматических гипермутаций генов иммуноглобулинов [1]. Соматические гипермутации — это один из базовых механизмов формирования разнообразия антигенраспознающих структур иммунокомпетентных клеток [2]. Фермент обладает прямой антиретровирусной активностью при условии высокого внутриклеточного содержания рибонуклеопротеидов и свободной РНКазы [3], участвует в процессах репарации ДНК и биодеградации свободных нуклеотидов, задействован в метаболизме аминокислот. Недостаточность системы, индуцирующей соматические гипермутации, приводит к иммунодефицитам различной степени выраженности [3]. Среди методов изучения активности фермента цитидиндезаминазы значительный удельный вес по-прежнему занимают биохимические спектрофотометрические и колориметрические тесты. Индофенольная колориметрическая реакция, где в качестве субстрата используются растворы нуклеозидов, экономически выгодна и достаточно наглядно отражает уровень активности ЦДА в сыворотке крови. Потому стандартизация и повышение точности данного метода исследования может быть полезна для внедрения его в клиническую практику.

Цель: сравнение активности фермента цитидиндезаминазы по отношению к цитидину и гемцитабину.

Материалы иметоды. Растворы цитидина и гемцитабина в концентрации 21 мМоль/л, фенольно-нитропруссидный раствор — 106 мМоль/л, растворы нитропруссида натрия — 50 мг/л и 200 мг/л, раствор гипохлорита натрия в концентрации 11 ммоль/л. Сыворотки крови от 10 здоровых добровольцев. Активность цитидиндезаминазы измерялась в индофенольной колориметрической реакции по методике Giutsi со следующим соотношением реакционных компонентов: 200 мкл субстратного раствора: 20 мкл исследуемой сыворотки: 600 мкл фенольно-нитропруссидного раствора: 600 мкл основного раствора гипохлорита натрия. Инкубация проводилась при 37°C в пробирке типа Эппендорф объемом 1,5 мл в течение 22 часов. Для учета результатов использован 96-луночный планшет, иммуноферментный анализатор-мультискан. Обработка полученных данных произведена с помощью программы Microsoft Excel 2010.

Результаты работы. Цитидиндезаминаза активна в отношении большого количества минорных нуклеозидов и нуклеозидоподобных соединений [14]. Находящаяся на вершине фенольного кольца — NH2 — группа может относительно легко отрываться как в случае цитидина, так и в случае гемцитабина, что позволяет использовать раствор гемцитабина в качестве субстратного раствора при проведении индофенольной колориметрической реакции.

Основная проблема в исследованиях активности цитидиндезаминазы в плазме связана со стандартизацией нормальных показателей ферментативной активности. Есть две тенденции в интерпретации сывороточной активности цитидиндезаминазы: первая постулирует активность данного фермента как вариабельный признак, характеризующийся высокой степенью спонтанных колебаний; вторая тенденция связана с тем, что активность цитидиндезаминазы в плазме характеризуется крайне низким уровнем и любое значительное повышение имеет высокую диагностическую значимость. Выделение из общей группы здоровых добровольцев лиц только мужского пола от восемнадцати до двадцати пяти лет делалось с целью ввести оптимальный уровень активности ЦДА.

По результатам исследования значения активности ЦДА в отношении цитидина и гемцитабина сопоставимы (таблица 1).

Таблица 1

Оптическая плотность растворов после инкубации иактивность ЦДА вреакциях дезаминирования цитидина игемцитабина

Показатели оптической плотности при реакции с гемцитабином достоверно отличаются от таковых со стандартным раствором цитидина (p<0,05). Показатели оптической плотности в индофенольной колориметрической реакции после 22-ти часовой инкубации для цитидина и гемцитабина показали слабую положительную корреляцию с коэффициентом регрессии R=0,64, что может быть объяснено малым объемом выборки (рисунок 1).

Рис.1. Связь между значениями оптической плотности в индофенольной колориметрической реакции при использовании цитидина и гемцитабина в качестве субстратов

Выводы

1. Использование атипичного нуклеозида — гемцитабина — целесообразно для определения активности цитидиндезаминазы.

Литература:

1. Дашкевич, А. М. Безопасность и эффективность вакцины «Флюваксин» при иммунизации военнослужащих / А. М. Дашкевич и др. // Здравоохранение, 2011. –2011. — № 12 — C. 36–40.
2. Павлов, К. И. Цитидиндезаминаза и аденозиндезаминаза — ферменты, контролирующие интенсивность и специфичность иммунного ответа: стандартизация активности в норме и диагностическая значимость при заболеваниях / К. И. Павлов, Л. П. Титов, А. Е. Гончаров, О. А. Янович, С. В. Жаворонок // Медицинский журнал — 2014. — № 4.
3. Selection of the best blood compartment to measure cytidine deaminase activity to stratify for optimal gemcitabine or cytarabine treatment / G. J.Peters, R. J. Honeywell, M. Maulandi // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids–2014 — № 33 — C. 403–412.