Исследуется автоматизация работы с ДНК-микрочипами. Решаются такие задачи, как сокращение временных затрат и упрощение процедуры формирование множества маркеров при изготовлении микрочипа. Разрабатываемая система является инструментом для генетиков и предназначена для использования в учреждениях здравоохранения.
Ключевые слова: ДНК-микрочип, маркеры, гены, мутации.
The automation of work with DNA microarrays is investigated. We solve such tasks like reducing the time expenditure and simplification of set markers formation procedure in the DNA-microarray fabrication. The developed system is an instrument for geneticists for using in health care.
Keywords: DNA microarray, markers, genes, mutations.
ДНК-микрочип (англ. DNA microarray) — это сложная технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. ДНК-микрочип представляет собой небольшую поверхность, на которую с большой плотностью в определённом порядке нанесены фрагменты одноцепочечной синтетической ДНК с известной последовательностью. Эти фрагменты выступают в роли зондов, с которыми гибридизуются (образуют двуцепочечные молекулы) комплементарные им цепи ДНК из исследуемого образца, обычно меченные флуоресцентным красителем. Чем больше в образце молекул ДНК с определенной последовательностью, тем большее их количество свяжется с комплементарным зондом, и тем сильнее будет оптический сигнал в точке микрочипа, куда был «посажен» соответствующий зонд. После гибридизации поверхность микрочипа сканируется, и в результате каждой последовательности ДНК ставится в соответствие тот или иной уровень сигнала, пропорциональный числу молекул ДНК с данной последовательностью, присутствующих в смеси.
С помощью данных микрочипов можно изучать экспрессию генов в различных тканях в норме и при патологии, изменение экспрессии генов с течением времени, прогнозировать предрасположенность человека к различного рода заболеваниям. Большинство операций при работе с микрочипом выполняются вручную и требуют значительных временных затрат, что также сказывается на стоимости.
Задачей исследования является разработка системы, позволяющей генетику упростить процесс поиска маркеров на этапе формирования микрочипа. Цель состоит в сокращении времени, затрачиваемого на весь процесс формирования микрочипа с момента постановки задачи до получения набора маркеров требуемых заболеваний.
Процедура анализа ДНК пациента осуществляется в несколько этапов:
1. обработка ДНК пациента;
2. гибридизация и отмывка;
3. сканирование полученного чипа;
4. анализ изображения;
Анализируемая ДНК пациента перед нанесением метится специальными флуоресцентными красителями. После гибридизации и отмывки мы получаем чип, который в последующем сканируется. Результатом сканирования является изображение, представляющее собой поле со светящимися точками. Точки — это те места, где меченый зонд строго специфично связался с теми фрагментами ДНК, что были помещены на чип. Далее производится анализ полученного изображения.
Если святящийся сигнал обнаружен на месте, где был напечатан фрагмент с мутацией, то далее производится поиск связей между данной мутацией и заболеваниями, которые она провоцирует.
Также при формировании микрочипа помимо отобранных маркеров размещаются позитивные и негативные контроли.
Позитивные контроли реализуются с помощью фрагментов генов, которые активны постоянно. Данные точки должны светиться всегда, иная ситуация означает, что на каком-то этапе произошел сбой.
Негативные контроли осуществляются за счет фрагментов нечеловеческих генов, т. е. не имеющие гомологий в человеческом геноме. Данные точки не должны светиться в случае правильного выполнения процедуры.
В процессе изучения предметной области и семинаров со специалистами Инновационного Медико-Технологического Центра были сформированы следующие задачи:
- Формирование множества маркеров. Переход от поиска в статьях к использованию базы данных и инструменту выбора маркеров. Эта задача является актуальной, поскольку существующие в настоящее время базы данных генома человека не могут быть применены для разрабатываемого инструмента из-за неполноты данных.
- Выбор расположения маркеров на микрочипе. Задача определяет ряд требований к параметрам набора маркеров, а именно, отобранные маркеры должны иметь определение своего типа для определения места на микрочипе, принадлежность РНК к гену-«родителю», связь между нормальной и патогенной РНК. Окончательное утверждение расположения маркеров утверждается генетиком.
- Выбор расположения маркеров на планшете. Задача перехода от сетки маркеров микрочипа к особенностям распечатки с планшета, направлена на автоматизацию работы лаборантов.
- Обработка изображений и вывод результатов. Выполнение задачи решает вопрос о том, какие из заложенных в 1-й задаче маркеров активны. Сначала проводится идентификация пятен и отделение их от ложных сигналов. Микрочипы сканируются после гибридизации и генерируется TIFF-файл изображения. Как только формирование изображения завершено, изображение анализируется для определения точек.
- Анализ и связывание генов с прогнозируемыми заболеваниями. Решается, какие мутации являются возможными (и с какой вероятностью), на основании выявленных активных генов из предыдущего этапа. Окончательное решение принимает генетик.
Одной из наиболее трудоемких задач является процедура поиска необходимых маркеров. Сегодня поиск осуществляется полностью вручную, посредством анализа статей по соответствующей тематике. При этом отсутствуют общепринятые стандарты обозначения мутаций и единая регулярно обновляемая база, а бесплатный доступ к некоторым ресурсам ограничен. На данный момент процедура поиска маркеров полностью изучена, сформированный алгоритм представлен в виде блок схемы.
Рис. 1. Укрупненная схема формирования факторов
Также разработана структура базы данных, соответствующая требованиям генетиков.
Рис. 2. Структура базы данных
Использование базы, содержащей все необходимые для изготовления микрочипов сведения, позволила бы существенно сократить время, затрачиваемой на поиск необходимых маркеров. Однако такой подход имеет некоторые недостатки, самым существенным из которых является время, необходимое для последующего заполнения базы из различных источников.
В процессе консультаций со специалистами ИМТЦ выявлены наиболее важные запросы, позволяющие получить такую информацию, как список генов, связанных с определенным заболеванием, и список мутаций, связанных с тем или иным геном:
1. Ввод названия заболевания — > получение списка генов и последовательностей, связанных с этим заболеванием;
2. Ввод названия гена — > получение списка мутаций, связанных с этим геном.
После анализа существующих проблем и проведения поиска готовых решений были подтверждены необходимость в автоматизации и актуальность исследования. Разработка инструмента, соответствующего требованиям генетиков, позволит существенно повысить эффективность их работы при поиске и формирования множества необходимых маркеров.
Литература:
1. Microarray Overview // Genome Resource Facility. URL: http://grf.lshtm.ac.uk/microarrayoverview.htm
2. Microarray Technology // Premier Biosoft. URL: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/microarray.html
3. DNA Microarray Technology // National Human Genome Research Institute. URL: https://www.genome.gov/10000533/
4. Генетическое тестирование и патернализм в медицине // Био молекула. URL: http://biomolecula.ru/content/1413
